Актуальність ПЛР діагностики

ПЛР відноситься до делікатної методам діагностики. Вона дозволяє отримувати точні результати дослідження в найкоротші терміни після взяття зразка. За допомогою даного методу фахівцям вдається діагностувати наявність збудників, які можуть бути присутніми в організмі пацієнта, не вдаючись до трудомістким мікробіологічних методів. Крім того, за допомогою ПЛР діагностики можна визначити збудника інфекції в інкубаційний період, коли відсутні зовнішні прояви захворювання. Це дає можливість своєчасно почати лікування. ПЛР діагностика є досить актуальною в урології і гінекології, особливо при виявленні інфекцій, що передаються статевим шляхом.

Крім медичної діагностики, ПЛР застосовується в таких ситуаціях:

• в кримінальних розслідуваннях;
• для встановлення спорідненості;
• в персоналізованої медицини;
• для клонування генів;
• в мутагенезі.

У криміналістиці ПЛР застосовується з метою визначення так званих генетичних відбитків. Матеріал, відібраний на місці подій, порівнюють з матеріалом обвинуваченого. Для аналізу застосовують будь-яку біологічну рідина - кров, сперму, сечу, слину, а також фрагменти тканин - волосся, епітеліальні клітини.

Батьківство встановлюють, проводячи кілька порівнянь, що пояснюється унікальністю генетичної інформації.

Попереднє генотипування, що застосовується в персоналізованої медицини, дозволяє встановити наявність рецепторів і ступінь їх чутливості до антибіотиків. Це істотно спрощує вибір медикаментозних засобів для конкретного пацієнта. Метод ефективний по відношенню до пацієнтів, у яких сприйнятливість фармакологічних препаратів обумовлена генетичними особливостями.

Застосовуючи клонування генів, вченим вдається отримати велику кількість однакових ділянок ДНК. Надалі їх застосовують в генній інженерії. Проведення мутагенезу за допомогою ПЛР набуло широкого поширення в експериментальній медицині, селекційної діяльності, при виробництві медичних препаратів.

Процес проведення діагностики методом ПЛР

Про особливості підготовки в кожному конкретному випадку пацієнта інформує лікуючий лікар. Але є кілька загальних принципів, яких слід дотримуватися всім пацієнтам, спрямованим на ПЛР.

Обстеження необхідно проводити до початку прийому антибактеріальних препаратів. За 2-3 діб до взяття матеріалу потрібно утриматися від статевих контактів. В цей же час не можна застосовувати контрацептиви місцевої дії, протимікробні вагінальні свічки і таблетки, спринцювання. Після кольпоскопії, гінекологічного огляду, вагінального УЗД повинно пройти не менше трьох діб. Оптимально, якщо мазок буде взятий в середині циклу. І жінкам, і чоловікам, не можна мочитися за три години до обстеження.

Діагностика інфекцій методом ПЛР починається з паркану фахівцем матеріалу, який підлягає дослідженню. Його поміщають в спеціальний невеликий контейнер з фізіологічним розчином і направляють в спеціальну лабораторію - ПЛР.

Суть ПЛР діагностики полягає в ампліфікації - процесі відтворення великої кількості копій ДНК. Побудова ДНК походить за принципом комплементарності. Що це означає? ДНК складається з чотирьох нуклеотидів - аденіну, тиміну, гуаніну, цитозину. Через особливості хімічної будови аденін може з'єднуватися тільки з тиміном, гуанін - з цитозином. ДНК кожного організму - індивідуальна. Виявивши невеликий її ділянка, можна з упевненістю встановити, кому саме він належить.

Дослідження в лабораторії проходить в кілька етапів:

• виділяється ДНК;
• ДНК фрагменти амліфіціруются;
• проводиться детекція ДНК-продуктів ампліфікації.

Якщо розглядати дуже спрощено, то весь хід ПЛР діагностики полягає в наступному. Спочатку ДНК-матрицю, тобто ту ДНК, яку потрібно ідентифікувати, нагрівають до певної температури. Це потрібно для того, щоб двуспіральная молекула розпалася на окремі ланцюги. Дана фаза називається денатурацією.

Наступна фаза діагностики - отжиг. Після денатурації дослідник одержує окремі ланцюга молекули ДНК. Потім температуру знижують. До початку і кінця ланцюжка приєднуються праймери - короткі фрагменти нуклеїнових кислот. Вони позначають початок і кінець ділянки, який потрібно ампліфікувати.

Після цього починають свою роботу ферменти - полімерази. Вони будують відсутню частину молекули таким чином, що на виході дослідник отримує типову двуспіральную молекулу нуклеїнової кислоти. Цей процес, званий репликацией, здійснюється за правилом комплементарності, про який згадувалося вище. Це остання фаза ПЛР - елонгація.

Потім слідує етап ідентифікації ДНК. Це і є діагностика інфекції. Вона здійснюється за допомогою електрофорезу або мічених праймерів. У першому випадку нитки ДНК лінізіруют, тобто, «розкручують» спіраль, щоб вона придбала лінійну форму. Під впливом електричного поля молекули здатні мігрувати від катода - електрода, зарядженого негативно, до анода - електроду, зарядженого позитивно. Реакція відбувається в спеціальному агарозному гелі. Чим довша нитка ДНК, тим нижче швидкість її пересування. Розмір нитки встановлюють, порівнюючи її зі зразком. Кількість визначається за яскравістю після обробки спеціальними речовинами.

Якщо для діагностики інфекції використовують мічені праймери, то після завершення ПЛР до отриманого продукту додають хромоген - спеціальну речовину, яка при взаємодії з ферментами забарвлює матеріал. Зміна забарвлення говорить про наявність збудника інфекції в матеріалі.

Крім звичайної ПЛР, лабораторіям доступні багато її різновидів. До основних з них відносяться:

• вкладена діагностика, при якій застосовують дві пари «запалів»;
• інвертована - застосовується в тих ситуаціях, коли відомий маленьку ділянку, що знаходиться всередині молекули. У цьому випадку реакція йде від центру до країв;
• ПЛР з реверсного транскрипцією;
• асиметрична полімеразна ланцюгова реакція - дозволяє отримати копії однієї з ланцюгів молекули; діагностика інфекції кількісної ПЛР - завдяки використанню мічених праймерів можна виміряти кількість отриманого продукту;
• ступінчаста діагностика - характеризується зміною температури в фазі відпалу;
• полімеразна ланцюгова реакція в гелі - дає можливість отримати колонії молекул на поверхні акріламідного гелю;
• ПЛР довгих фрагментів;
• полімеразна ланцюгова реакція полиморфной ДНК - застосовується для розрізнення генетично близьких організмів.

показання

Проводити ПЛР діагностику інфекцій пацієнтам необхідно в наступних випадках:

• при наявності зовнішніх симптомів, що вказують на інфекцію, що передається статевим шляхом;
• після незахищеного статевого акту з новим партнером;
• при хронічних запальних захворюваннях сечостатевої системи - для діагностики інфекції, що стала їх причиною;
• при ускладненій вагітності;
• за передчасні пологи, мимовільних абортах, часта причина яких - інфекція;
• для діагностики інфекцій, які можуть бути причиною безпліддя;
• для визначення чутливості до антибактеріальних препаратів;
• для контролю ефективності лікувального процесу.

розшифровка аналізу

Негативний результат при діагностиці інфекцій методом ПЛР вказує, що досліджуваний матеріал не має ніяких слідів інфекційних агентів. Відповідно, пацієнт, який здав аналізи, є здоровим. Позитивний результат полімеразної ланцюгової реакції вказує на наявність слідів інфекції в досліджуваній пробі.

Трапляється, що результат ПЛР діагностики інфекцій виявляється позитивним, але активної інфекції в організмі пацієнта немає. Такий випадок говорить про «здоровому носійстві», яке не вимагає і не піддається лікуванню.